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A agregação plaquetária ocorre devido à formação de pontes de fibrinogênio, pois este se liga ao receptor na membrana plaquetária, GP IIb/IIIa, que na presença do Ca++ forma um complexo estável na superfície das plaquetas ativadas. Essa também ocorre devido ao metabolismo do ácido aracdônico, sendo o mesmo liberado a partir da membrana fosfolipídica das plaquetas pela ativação da enzima fosfolipase A2 e, subseqüentemente, a enzima cicloxigenase (COX-1) converte o ácido aracdônico em endoperóxidos cíclicos. Esses são então convertidos pela tromboxana sintetase à tromboxana A2 (TXA2), funcionando como um potente agonista que induz a agregação. As células endoteliais também possuem essa via do metabolismo do ácido aracdônico, entretanto, as células preferencialmente convertem endoperóxidos cíclicos em prostaciclina (PGI2), um importante inibidor da agregação plaquetária.1-7

O uso da aspirina como uma potente droga anti­trombótica tem sido analisada há mais de trinta anos na clínica médica em pacientes que fazem uso da mesma, visto que este medicamento acetila irreversivelmente a enzima COX-1 prevenindo a geração de tromboxana A2 (TXA2), um potente ativador da agregação plaquetária. O papel da adenosina difosfato como o principal estimulador da agregação plaquetária foi descoberto por outros importantes pesquisadores, assim como as propriedades de agregação do colágeno e trombina, a reação de liberação e o metabolismo do ácido aracdônico.5-8

A amplificação e propagação contínua da agregação plaquetária é ativada pela formação de agregados plaquetários e a expulsão de ADP e de outras substâncias ativas das organelas plaquetárias. Antes, ou ao mesmo tempo da reação de liberação, tem-se uma primeira alteração estrutural bem definida nas plaquetas ativadas, representada por uma transformação do formato discóide para esferas espinhosas com protusões ou filópodes, sendo esta considerada como a primeira e reconhecida mudança no formato plaquetário. Isso ocorre devido à ativação do sistema contrátil da plaqueta, sendo que alguns pesquisadores a consideram uma etapa distinta na função plaquetária. Experimentos in vitro e sob condições controladas evidenciaram que a mudança no formato da plaqueta, bem como a fase inicial da agregação, precede a reação de liberação, embora a seqüência exata dos eventos in vivo ainda não tenha sido elucidada. A isso, segue-se a ativação ou disponibilidade do fator 3 plaquetário (PF-3) e outras substâncias pró-coagulantes, com o início da hemostasia secundária da coagulação, levando à consolidação da rolha plaquetária pela fibrina, com subseqüente retração do coágulo.3,9,10,11

A agregação plaquetária é um teste que avalia a função das plaquetas pela exploração de diferentes vias de ativação plaquetária in vitro, quando um plasma citratado rico em plaquetas (PRP) é continuamente agitado por uma esfera de ferro em um aparelho denominado agregômetro de plaquetas. Esse aparelho mede uma combinação de absorção e dispersão de luz, tendo-se hoje aparelhos que permitem tanto medições nefelométricas, quanto foto­métricas. Constitui um processo que registra alterações na transmissão da luz, pois, ao adicionar agentes agonistas, tem-se um decréscimo da mesma devido à mudança na forma das plaquetas, que passam de discóides a esféricas. Isto é seguido de um aumento gradual na transmissão de luz, devido à agregação das plaquetas, o que torna o meio mais claro. Este teste é válido para mostrar o defeito da hemostasia primária, quando se suspeita da história clínica do paciente e na presença de um prolongamento do tempo de sangramento.12-18

Dessa forma, o agregômetro permite mensurar parâmetros temporais, semiquantitativos e qualitativos na agregação in vitro. A resposta das plaquetas a vários agentes agregantes como adenosina difosfato (ADP), colágeno, adrenalina (ADR), trombina e ácido aracdônico (AA) pode ser quantificada no plasma rico em plaquetas ou no sangue total. Comparativamente aos outros testes que avaliam a hemostasia primária, essa técnica parece representar o melhor auxílio diagnóstico laboratorial na verificação dos distúrbios qualitativos adquiridos ou congênitos das plaquetas.18

A agregação plaquetária exibe uma resposta bifásica de uma agregação reversível (1ª onda ou agregação primária), seguida de uma agregação irreversível (2ª onda ou agregação secundária), que ocorre devido à desintegração das plaquetas associada com, mas não necessariamente, a conseqüência da reação de liberação.3,18-21

Os agentes primários, como, por exemplo, adenosina difosfato, adrenalina, noradrenalina, serotonina, vaso­pressina e trombina são capazes de iniciar a agregação plaquetária diretamente por mecanismos que não dependem da produção de prostaglandinas ou da liberação de ADP contido nas plaquetas. Já os agregantes secundários, como, por exemplo, acetilcolina, araquidonato, ácidos graxos, fator de agregação plaquetária, agentes infecciosos e seus produtos produzem a agregação pela indução da liberação de ADP e/ou produção de prostaglandinas e metabólitos relacionados com as plaquetas.3

No presente trabalho foi nosso propósito obter traçados de ondas de agregação plaquetária para nossa padronização utilizando nosso grupo controle de doadores de sangue e compará-las com nosso grupo estudo, frente a diferentes agentes agonistas em diferentes concentrações.

Casuística e métodos

Os grupos analisados foram constituídos por 41 pacientes cardíacos e por 40 doadores de sangue considerados como nosso grupo controle. Dos pacientes cardíacos, 33 faziam uso regular do AAS na concentração de 200 mg/dia e oito pacientes na concentração de 100 mg/dia, sendo todos considerados hipertensos, por especialistas clínicos.

Do primeiro grupo, 12 eram do sexo masculino e 21 do sexo feminino, com faixa etária variando dos 46 aos 88 anos. Do segundo grupo, sete eram do sexo feminino e um do masculino, com faixa etária variando dos 57 aos 84 anos.

Entre os doadores de sangue a faixa etária variava dos 18 aos 49 anos, sendo dez do sexo feminino e trinta do sexo masculino.

Para a realização da agregação plaquetária foram coletados 18 mL de sangue total por punção venosa, sendo este coletado em seringas plásticas de 20 mL e transferidos para quatro tubos de 4,5 mL siliconizados a vácuo contendo anticoagulante citrato de sódio tamponado a 0,109 M.

A agregação plaquetária foi verificada em agregômetro da marca NET LAB 2020 duplo canal, estandartizado na temperatura de 37º C, frente a agentes agonistas.

A agregação plaquetária foi realizada dentro das quatro horas após a coleta do sangue, sendo primeiramente obtido o plasma rico em plaquetas (PRP) por centrifugação a 40 g durante dez minutos e depois o plasma pobre em plaquetas (PPP) por centrifugação a 750 g durante quinze minutos em centrífuga de 8,5 cm de raio. O PRP foi transferido com cuidado sem encostar a ponteira na parede do tubo e em seguida realizada a contagem de plaquetas, sendo estas corrigidas para 250.000 plaquetas/mm3. Após a correção, foi realizada a verificação da agregação frente aos agentes agonistas em diferentes concentrações: ADP 1µM e 3 µM; AA, 0,5mM e ADR, 0,05 mg/mL, 0,025 mg/mL e 0,010 mg/mL.

A padronização da agregação plaquetária foi realizada com a utilização de quatro pools diferentes, constituído cada um de plasma de dez doadores de sangue, obtidos em dias diferentes e realizada a observação em agregômetro estandartizado em fornecer curva dentro dos cinco primeiros minutos de agregação.22

Resultados e discussão

A padronização da agregometria estava na dependência do encontro de traçados correspondentes a ondas de agregação nas nossas condições laboratoriais. Além dessas ondas que poderiam ser indicativas do processo agregação, desagregação e nova agregação (fornecendo primeira e segunda onda, ou seja, uma resposta bifásica) ou fusão dessas ondas (representando um perfil monofásico) ou agregação e desagregação (com o aparecimento de apenas uma onda primária), podemos obter o resultado da agregação final em porcentagem no tempo de cinco minutos estandartizados pelo aparelho.

Do mesmo modo foi nosso propósito realizar a agregação em aparelho automático estandartizado na temperatura de 37º C, já que a temperatura influencia na agregação e desagregação, sendo que a 20º C a agregação é menor que a 37º C e o ADP não causa agregação a 0º C, exceto quando usado em altas concentrações.11

Vários inibidores da agregação plaquetária têm sido estudados demonstrando a importância e ação de diferentes compostos em promover essa agregação, quer seja in vivo ou in vitro. Apesar de existirem numerosos produtos que podem ser avaliados como promotores da agregação plaquetária in vitro, podemos destacar o ADP, a ADR e o AA, principalmente se considerarmos o propósito de analisarmos pacientes que fazem uso do AAS.11 O ADP tem sido considerado o principal causador da mudança na forma da plaqueta, sendo essa essencial para que as mesmas sejam capazes de aderir umas às outras.13

Estudos em diferentes espécies de mamíferos indicam que o ADP induz a agregação plaquetária em PRP citratado ou heparinizado e que o cálcio é necessário na agregação.11 Isto justifica, o uso de plasma citratado e rico em plaquetas na realização da agregação plaquetária.

Dessa forma, quando utilizado ADP nas concentrações de 1µM e 3 µM, foi observado na concentração de 1 µM uma resposta bifásica, enquanto para a concentração de 3 µM uma resposta com primeira e segunda onda integradas (Figura 1), dados estes concordantes com Zucker,18 Guerra e colaboradores,23 e Kanayama.22

Zucker18 afirma que uma concentração entre 1 µM e 2 µM de ADP resulta em uma agregação bifásica, sendo que a segunda onda está associada à secreção dos grânulos densos das plaquetas. Ambos, segunda onda de agregação e secreção, dependem da formação de endoperóxidos e tromboxana A2 (TXA2), a partir do ácido aracdônico e da secreção do ADP dos grânulos densos. Ocorre fusão das duas fases quando da utilização de alta concentração de ADP, o que pode ser visualizado na figura 1.

Segundo Guerra e colaboradores,23 e Kanayama,22 ao expor as plaquetas ao ADP, este se une aos receptores específicos na membrana plaquetária, causando a ativação da plaqueta, resultando na liberação do AA, dos fosfolipídeos da membrana através da ativação das fosfolipases e da metabolização a TXA2, com conseqüente contração e liberação do conteúdo plaquetário ao meio. As plaquetas, ao serem estimuladas com ADP, fornecem uma curva de agregação induzida bifásica, sendo a primeira onda um processo que envolve a formação de pontes de fibrinogênio entre as plaquetas. A segunda onda corresponde à fase de secreção ou liberação do conteúdo dos grânulos. Normalmente com ADP 1 µM, podemos observar as duas curvas e com ADP 3 µM, não podemos distinguir a primeira da segunda onda, como evidenciado na figura 1. No caso do uso da ADR, utilizada nas concentrações de 0,05 mg/mL, 0,025 mg/mL e 0,010 mg/mL, obteve-se para todas essas concentrações uma agregação bifásica (Figura 2).

A ADR causa agregação plaquetária no plasma citratado rico em plaquetas, sendo que em baixas concentrações fornece uma resposta bifásica e libera ADP das plaquetas, potencializando sua ação. Não causa mudanças na forma ou agregação primária, mas sim uma agregação secundária, sendo esta acompanhada de mudanças na forma plaquetária.11,18

A agregação induzida pela adrenalina segundo Guerra e colaboradores,23 e Kanayama,22 ocorre pois esta estimula os receptores alfa adrenérgicos, de forma a inibir a adenilciclase, reduzindo a concentração de AMP cíclico intraplaquetário e também imobiliza o cálcio ionizado das organelas ativando as plaquetas, levando à liberação do ácido aracdônico endógeno com formação de TXA2 , contração e secreção plaquetária. A curva de agregação induzida por esse agregante é bifásica como no caso do ADP, correspondendo a primeira onda à fixação do fibrinogênio ao complexo de glicoproteínas IIb/IIIa da membra­na plaquetária e a segunda onda à formação de TXA2 e secreção plaquetária.

O ácido aracdônico para causar agregação depende da transformação da cicloxigenase a endoperóxidos e TXA2, sendo entretanto totalmente inibido por antiinflamatórios não esteroidais que inibem a cicloxigenase.18

No caso do ácido aracdônico (AA), utilizado na padronização nas concentrações de 1,5 mM, 1,0 mM e 0,5 mM, foi obtido uma resposta monofásica para as concentrações de 1,5 e 1,0 mM , enquanto para a concentração de 0,5 mM foi observada claramente uma resposta bifásica (Figura 3).

A opção de utilizar o AA como agente agregante em estudo de pacientes que utilizavam o AAS, foi para observar se realmente esse medicamento estava tendo o efeito inibitório de acetilar irreversivelmente a COX-1, prevenindo a geração de TXA2, um potente ativador da agregação plaquetária, visto que, o AA causa agregação dependendo da transformação da COX-1 a endoperóxidos e TXA2 .18

No caso dos nossos pacientes analisados em ambas as concentrações de AAS 100 mg/dia e 200 mg/dia, comparando-os com nosso grupo controle utilizado na padronização, foi possível observar que na presença dos agentes agregantes ADP 3 µM; ADR 0,05 mg/mL, 0,025mg/mL e 0,010 mg/mL os pacientes apresentaram 1aonda mas não 2ª onda. Por sua vez para o AA 0,5 mM não houve o encontro de traçados de ondas.

O estabelecimento da padronização para a realização da agregação plaquetária pôde permitir estipular valores de referências válidos para o nosso equipamento e nossas condições laboratoriais, frente à ação de diferentes agentes agregantes, concentrações e frente à ausência do agente agregante.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Dra. Tânia Rúbia Flores da Rocha, responsável pelo laboratório de coagulação do Hospital das Clínicas de São Paulo pelo auxílio durante o trabalho, ao professor Dr. Amauri Antiquera Leite pela oportunidade de realizar o trabalho utilizando os aparelhos necessários e ao Dr. José Maria Silveira de Souza, responsável pelo Laboratório Deltha Análises Clínicas de São Carlos pela disponibilidade em emprestar o aparelho para a realização da agregação plaquetária, que foi fundamental na realização desse trabalho.