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Como fazer o Teste de Paternidade?

O teste de paternidade de DNA é uma metodologia molecular utilizada para determinar se dois indivíduos possuem vínculo biológico ou não, comparando as sequências de DNA (alelos) entre eles. Pode ser utilizado como prova legal para reivindicações de herança, direitos paternos, benefícios sociais e outras circunstâncias que necessitam de uma prova de parentesco.

Contudo nem todos os testes de paternidade são aceitos no sistema jurídico, isto porque a colheita de ADN deve obedecer a padrões restritos e a uma custódia documental. Logo, as colheitas de ADN que são efetudas em casa, a partir de Kits de ADN, esses exames não tem validade Jurídica.

Para os testes de paternidade terem validade jurídica devem de obedecer a rigorosos procedimentos de colheita e transporte de amostras. Os testes de paternidade com valor legal devem respeitar, sobretudo, as leis de cada país, não é possível executar um teste de paternidade com validade em qualquer parte do mundo, mas é possível dividir em duas grandes partes: Certificações AABB, ISO17025 e CLIA permite a entrega dos exames nas embaixadas por exemplo dos E.U.A., Canadá, Austrália, Reino Unido e maioria dos países Europeus.

Relativamente à ciência envolvida no exame de paternidade.

Quando uma criança nasce herda 50% do ADN da sua mãe e 50% do ADN do seu pai. Os 50% que herda do pai é uma mistura de todo o ADN do pai (ex: se o pai tem 40 marcadores genéticos a criança herda aleatoriamente 20 marcadores genéticos desses 40, por isso, é que os irmãos são diferentes, porque cada um herdou um conjunto aleatório de 20 dos 40 marcadores do pai, o mesmo se passa com a mãe são herdados 20 marcadores aleatórios).

Antigamente, antes da existência do ADN, eram utilizados outros métodos para aferição da paternidade, como a cor dos olhos, tipo de sangue e lóbulo da orelha. Existem calculadoras online que fazem estes cálculos de paternidade , contudo, este cálculo nunca substituí um exame de paternidade.

Marcador genético

Figura 1: A) Representação de STR em um segmento de DNA. B) Representação de um loci gênico (vermelho) heterozigoto mostrando diferentes perfis alélicos para um STR.

Um marcador genético é qualquer variação na sequência do DNA de um ser vivo que o diferencie de outro indivíduo – ou grupo de indivíduos – ou que permita a identificação de uma característica específica inerente a ele. Podem ser utilizados com diversas aplicabilidades, como a caracterização de doenças genéticas e novos medicamentos, e também para a identificação de indivíduos, com grande utilidade para a genética forense e testes de paternidade.

A matéria-prima da variabilidade genética é a ocorrência de mutações. Estas, ao se perpetuarem com frequência acima de 1% na população, passam a ser reconhecidas como polimorfismos genéticos. Alguns polimorfismos podem ser utilizados como marcadores e os STR (short tandem repeat), ou microssatélites, são os mais comumente aplicados em testes de paternidade por DNA.

Os STR são formados por pequenos motivos (de 1 a 8 nucleotídeos) repetidos sequencialmente e são encontrados em regiões não codificantes por todo o genoma. Estes marcadores apresentam alta variabilidade, determinada tanto pelo motivo a ser repetido quanto pela quantidade de vezes em que aparece.

Desta forma, como cada indivíduo recebe um alelo do pai e o outro da mãe, a comparação entre loci hipervariáveis da pessoa analisada com os do suposto pai e confirmados com os herdados da mãe, é uma forma altamente discriminatória de determinar se há vínculo genético entre eles ou não.

Contudo e apesar de haver uma forma altamente discriminatória, na execução do exame de paternidade é sempre preciso garantir um número minimo de marcadores genéticos, quantos mais marcadores genéticos mais confiável é o exame de paternidade.

Centenas de loci STR já foram identificados e, atualmente, utilizam-se sistemas comerciais formados por conjuntos de marcadores (CODIS, NGM, IDENTIFILER, entre outros) específicos para identificação humana que apresentam um alto grau de certeza.

Metodologia do Teste de Paternidade

Todas as células do corpo de um indivíduo possuem a mesma informação genética. Desta forma, o DNA pode ser obtido de praticamente todas as fontes de tecido humano, sendo as mais frequentes para este tipo de teste o sangue e a mucosa oral.

Figura 2: esquema de teste de paternidade para um locus. A criança recebeu o alelo marcado em verde da mãe e o marcado em azul do pai.

Depois de feita a coleta do material biológico, é preciso extrair o DNA das células e quantificá-lo para saber se há quantidade suficiente para amplificação. Em seguida, inicia-se a amplificação por PCR (polimerase chainreaction) com oligonucleotídeos específicos que flanqueiem o STR. Mais especificamente, é realizada técnica de PCR multiplex, na qual são incluídos pares de oligonucleotídeos para múltiplos segmentos gênicos que são amplificados simultaneamente.

Atualmente, estão disponíveis kits comerciais para a realização de PCR multiplex com alvos STR. Dois deles são o PowerPlex® 16 kit (Promega) e o AmpFISTR®IdentifilerTM kit (AppliedBiosystems), que amplificam 16 STR simultaneamente usando oligonucleotídeos marcados com fluorescências de diferentes cores. Após a amplificação, as amostras são submetidas à eletroforese em gel de acrilamida ou capilar para separação dos fragmentos de acordo com o tamanho molecular. Os equipamentos mais utilizados hoje em dia são os sequenciadores automáticos ABI 3130 e ABI3500, que possibilitam detecção de fluorescência multicolor.

Na prática, o resultado dessa análise para cada STR é representado por bandas relativas aos dois alelos daquele locus onde um dos alelos do filho necessariamente tem que ser igual ao da mãe e o outro igual ao do pai biológico (fig 2).

Por fim, a comparação destes perfis deve ser acompanhada de análise estatística para estabelecer a probabilidade de vínculo biológico.

Cálculos de paternidade

Figura 3: esquema dos cálculos realizados para análise estatística dos resultados obtidos pelo teste de paternidade.

Para alcançar um resultado confiável, é necessário realizar uma análise estatística. O índice de paternidade (IP) resume a informação fornecida pelo exame. Nesse índice, é calculada a probabilidade do suposto pai ser o pai biológico da criança, contra a probabilidade de qualquer outro indivíduo ser o pai. Para tal, considera-se que, em uma população em equilíbrio de Hardy-Weinberg, a probabilidade de que um homem qualquer transmita um alelo específico para a criança em questão é igual à frequência deste alelo na população.

O cálculo do IP deve ser realizado para cada um dos loci utilizados individualmente. O produto dos IPs estudados irá gerar o Índice de Paternidade Cumulativo (IPC). O IPC indica se a hipótese de que o suposto pai é o pai biológico está mais próxima de ser verdade do que a hipótese de que qualquer outro homem o seja.

Como é desejado que esse suposto pai possua todos os marcadores, o resultado do cálculo combinado é colocado em uma fórmula para calcular a probabilidade dessa paternidade. A probabilidade de paternidade (PP) indica o quanto o teste será confiável. Essa análise é baseada no Teorema de Bayes, utilizando cálculo de probabilidade a posteriori, e baseada nos perfis alélicos observados para a mãe, para a criança e para o suposto pai.

Teste de paternidade com suposto pai falecido

Os testes de paternidade também podem ser realizados quando o suposto pai é falecido, neste caso, analisa-se o material genético de seus parentes próximos como pais, irmãos e outros filhos legítimos visando reconstruir o perfil genético do suposto pai. Porém, este processo pode sofrer limitações por escassez de indivíduos para análise, ocasionada tanto por falecimento, por ausência no país ou ainda por estes não desejarem fazer o teste. Caso não existam parentes próximos suficientes ou ainda se os testes com estes não obtiverem probabilidades aceitáveis de paternidade, torna-se necessário a exumação do corpo do suposto pai.

O material genético está presente em todas as células do nosso corpo, podendo ser extraído do sangue, sêmen, saliva, pelos, cabelos, pele, urina, secreções nasais e restos humanos. Em indivíduos falecidos há poucos dias, pode-se extrair material dos bulbos capilares ou do sangue conseguido através da pulsão das veias ou do próprio coração. Se o falecimento ocorreu em menos de quatro semanas, o material pode ser extraído do músculo esquelético. Se o tempo de falecimento for maior do que quatro semanas, o material analisado deve ser dos ossos (fêmur) ou dos dentes (molares e pré-molares), estes últimos são os melhores no caso de morte por fogo, pois a raiz dentária fica protegida pela estrutura do dente.

Os STRs do cromossomo Y também são bastante utilizados em identificação humana por DNA, pois têm características especiais que os tornam muito importantes,principalmente na investigação de paternidade. Por não haver recombinação durante a meiose, devido à falta de cromossomos homólogos, todos os membros do sexo masculino de uma mesma família possuem os mesmos alelos, que são herdados em blocos; a esse tipo de herança chamamos de herança haplotípica, e ao conjunto de alelos, chamamos haplótipos. Dessa forma, os STRs do cromossomo Y de um filho (do sexo masculino) será sempre igual à de seu pai, avô e tios.

Banco de dados de DNA

O primeiro banco de dados de DNA foi criado na Inglaterra nos anos 1990. No entanto, nos últimos anos, a grande expansão da biologia molecular e da bioinformática tem contribuído para o desenvolvimento de inúmeros bancos de dados de DNA no mundo todo. A criação desses bancos, atualmente, é uma tendência mundial. A princípio, a criação dos bancos se deu principalmente para contribuir com a polícia no esclarecimento de crimes cometidos, uma vez que evidências de DNA podem acusar ou inocentar um indivíduo de ter cometido um crime, tornando-se, assim, uma ferramenta utilizada nos tribunais.

No entanto, a importância dos bancos de dados de DNA vai além dos limites dos tribunais, sendo amplamente utilizada na busca por pessoas desaparecidas e também por biólogos moleculares e geneticistas para pesquisas e diagnósticos diversos, tais como doenças genéticas e testes de paternidade.

Diversos bancos de dados de interesse forense contendo frequências alélicas de várias populações vêm sendo criados nos últimos anos, tais como o Banco de DNA Mitocondrial, Banco dos Cromossomos autossômicos, do cromossomo Y e o Banco do Cromossomo X. Eles podem ser utilizados em práticas forenses, estudos antropológicos e evolutivos, além de outras pesquisas genéticas. Nesses bancos é possível encontrar vários dados de um marcador, como localizações físicas e genéticas, estruturas de repetição, nomenclaturas alélicas, taxas de mutações e alguns dados populacionais.

Quando se tem o objetivo de identificar um indivíduo, esses bancos são procurados para a obtenção de informações sobre as frequências alélicas dos marcadores utilizados para realização de análises específicas sobre a população alvo do estudo, bem como para cálculos dos parâmetros estatísticos.

Criando um pedigree para o cálculo estatístico de uma relação biológica complexa

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O conteúdo não verificável pode ser removido.—Encontre fontes: Google (notícias, livros e acadêmico) (Abril de 2021)

O pedigree do inglês, do português: linhagem, genealogia, ascendência ou árvore genealógica, permite aos geneticistas entender a dimensão do cálculo estatístico que determinada relação familiar poderá ter.

Exemplo de um pedigree para um teste de ADN entre dois alegado meios-irmãos

Quando é solicitado um teste de ADN de relações biológicas complexas, seja um teste de ADN entre irmãos, um teste de paternidade envolvendo tios paternos ou até mesmo um teste entre primos do primeiro grau é importante na altura de pedido do exame ser capaz de explicar toda a sua linhagem.

Uma árvore genealógica é desenhada sempre sobre os seguintes termos, os quadrados representam pessoas do sexo masculino, os círculos do sexo feminino.

Para a representação de uma pessoa ausente (por falecimento, paradeiro incerto ou outro) efetua-se um traço na diagonal por cima do respectivo símbolo.

Então para fazer a sua árvore genealógica de relações complexas tem que ter sempre em mente estas legendas.

Porque é importante ter a capacidade de desenhar a sua árvore genealógica na altura de pedir um teste de paternidade, que não envolva directamente o suposto pai, mas sim um familiar paterno?

Acima de tudo, porque um teste de paternidade com familiares paternos normalmente utiliza mais que um ADN, ou seja, além do ADN nuclear ou autossómico pode ser utilizado o cromossoma Y ou o cromossoma X é importante entender a herança genética vinda de linhas paternas anteriores. Assim utilizando o cromossoma Y juntamente com o ADN autossómico a conclusividade do exame será muito superior. Por vezes utilizando só o ADN autossómico nestes exames não é possível obter um índice de parentesco conclusivo.

Assim todos os pedigrees devem ter pelo menos uma ou duas linhagens, antes da linhagem em teste, para que se possa aferir com segurança todos os ADN que passaram de geração em geração. Ou seja, deve sempre incluir a geração dos seus pais e dos seus avós.